Séquençage de nouvelle génération pour les tumeurs malignes myéloïdes – progrès et applications pratiques

Au cours des deux dernières décennies, le séquençage de nouvelle génération (SNG) a révolutionné notre compréhension de la pathogenèse des néoplasies myéloïdes (NM) et de leur prise en charge clinique. Alors que le séquençage traditionnel par la méthode de Sanger permet l’interrogation de loci uniques, le SNG permet le séquençage parallèle de plusieurs emplacements génomiques, allant d’ensembles de gènes ciblés, à l’ensemble du génome. Initialement, le SNG était principalement utilisé en recherche, où la capacité d’interroger de grandes régions du génome facilitait la découverte de gènes mutés de manière récurrente dans les cancers myéloïdes. Peu de temps après, le SNG est entré dans le domaine clinique où il est maintenant couramment utilisé dans le diagnostic, le pronostic et la prise de décision en matière de traitement.  La grande disponibilité du SNG clinique s’accompagne cependant de son lot unique de défis. Les hématologues doivent interpréter des rapports moléculaires complexes et appliquer de manière appropriée et en temps réel, les informations mutationnelles aux soins de leurs patients. Par conséquent, une approche systématique dans l’interprétation des rapports de SNG est cruciale; c’est ce que nous couvrirons dans ce qui suit.

1) Comprendre l’étendue des altérations génétiques détectables par votre panel 

Une compréhension détaillée des mutations présentes dans les NM a émergé au cours des 20 dernières années. Le séquençage du génome entier et de l’exome d’échantillons de patients a conduit à la découverte d’un ensemble d’environ 40 gènes mutés de manière récurrente dans la leucémie myéloïde aiguë (LMA), le syndrome myélodysplasique (SMD) et les néoplasies myéloprolifératives (NMP). Il est important de noter que ces gènes peuvent être organisés en un nombre limité de catégories biologiques, mettant en évidence les processus cellulaires clés dont la dérégulation entraîne une myélopoïèse pathologique : l’épissage de l’ARN, la régulation épigénétique, le complexe cohésine, les facteurs de transcription, la réponse aux dommages à l’ADN et la transduction du signal (Tableau 1)^1,2.

Tableau 1. Gènes mutés récurrents dans les néoplasies myéloïdes. Les gènes en gras font partie de la liste minimale des gènes recommandés par l’Association of Molecular Pathology pour les néoplasies myéloïdes chroniques; adapté de McClure et al, 2018.

Des panels de SNG « myéloïdes » ciblés ont été développés en se basant sur ces gènes mutés de façon récurrente. L’Association of Molecular Pathology a proposé une liste minimale de gènes pour les néoplasies myéloïdes chroniques (Tableau 1, gènes en gras)³. Le contenu des panels de cellules myéloïdes peut cependant varier en fonction des gènes spécifiques inclus ainsi que de leurs régions couvertes (c.-à-d. : points chauds ou séquence codante complète). Les panels myéloïdes de première génération peuvent ne pas contenir de gènes dont la pertinence pour les NM est apparue plus récemment, tels que le PPM1D (impliqué dans la thérapie des NP)⁴ et le DDX41 (impliqué dans le SMD/LMA familial)⁵. Les plates-formes de SNG peuvent également différer d’un point de vue technique, influençant leur sensibilité et les types de variants pouvant être détectés. Par exemple, certains panels utilisent l’ARN comme matériau de départ, et peuvent détecter des réarrangements réciproques de gènes, tels que PML-RARA, RUNX1-RUNX1T1 et CBFB-MYH11, qui nécessitaient auparavant des tests autonomes basés sur la RT-PCR ou la cytogénétique/FISH pour leur détection⁶.

Pour aider les cliniciens, les rapports de SNG contiennent une mine d’informations, y compris les régions génomiques interrogées, la technologie du test, le pipeline d’analyse bio-informatique, ainsi que les types d’altérations génétiques qui peuvent être détectées avec leurs limites de sensibilité associées. Il est important pour les cliniciens d’être familiers avec ces détails techniques afin d’apprécier pleinement les forces et les limites de la plate-forme de SNG utilisée, et comment cela peut affecter en fin de compte, les variants qui sont rapportés.

2) Réviser les variants rapportés et les preuves de leur pathogénicité

Bien que les pratiques varient, les laboratoires moléculaires suivent les directives générales pour la déclaration des mutations⁷.Les variants génétiques sont répertoriés selon la nomenclature de la Human Genome Variation Society (HGVS) (Tableau 2)⁸. Les variants détectés peuvent aller de polymorphismes germinaux bénins, à des mutations activatrices (« driver ») pathogènes, en passant par des mutations accidentelles passagères sans impact perceptible sur la leucémogenèse. Compte tenu de cette complexité, les annotations des variants basées sur les évidences effectuées par des spécialistes du diagnostic moléculaire, sont une étape d’analyse essentielle en amont.

Tableau 2. Exemples de nomenclature des variants; adapté de den Dunnen et al, 2016.

Pour les NM, la méthode idéale pour distinguer les altérations associées aux tumeurs et les changements de la lignée germinale, consiste à comparer les schémas de mutation dans les fibroblastes cutanés à ceux présents dans le sang. Cependant, une telle analyse se limite généralement à l’investigation des syndromes de prédisposition héréditaire. Au lieu de cela, des polymorphismes germinaux probables sont identifiés à l’aide de données provenant de grandes bases de données qui ont regroupé les informations génétiques de populations saines, telles que la Genome Aggregation Database (gnomAD)⁹. En pratique, les variants dont la fréquence est supérieure à 1 % dans la population générale sont présumés représenter des polymorphismes germinaux . Ils sont filtrés et exclus avant d’être rapportés cliniquement. La variation dans les fréquences alléliques (VFA) peut également suggérer des altérations de la lignée germinale (c’est-à-dire : 40-60 % pour un statut hétérozygote); cependant, la VFA n’est pas une estimation entièrement fiable de la zygosité car elle peut être influencée par le nombre de copies ainsi que la proportion relative du clone de la cellule mutante¹¹. Les panels de SNG des cellules myéloïdes, bien que principalement axés sur la détection de variants somatiques, incluent des gènes tels que TP53, RUNX1, GATA2, CEBPA et DDX41, dont l’altération de la lignée germinale, peut prédisposer au développement de néoplasies myéloprolifératives^5,10. L’identification de tels variants dans le sang de patients ayant des antécédents familiaux ou une histoire clinique suggestive, devrait inciter à l’analyse plus poussée des fibroblastes de la peau pour confirmer le statut de la lignée germinale et référer vers le conseil génétique.

Un deuxième défi concerne l’évaluation de la pathogénicité des variants détectés. Ceci est généralement fait en regroupant les données probantes provenant de sources telles que des bases de données sur le cancer à grande échelle (c.-à-d. : The Catalogue of Somatic Mutations in Cancer, COSMIC)¹², des bases de données sur des populations saines (c.-à-d. : gnomAD), des bases de données de mutations cliniquement annotées (c.-à-d. : ClinVar), les outils in silico qui prédisent les conséquences fonctionnelles d’une mutation donnée (c.-à-d. : SIFT), et avant tout, littérature scientifique¹¹. Il existe un système largement utilisé, à quatre niveaux, fondé sur les données probantes et qui sert à catégoriser les variants (Tableau 3). Il facilite l’identification des variants d’importance clinique pour les hématologues⁷.

Tableau 3. Un système à 4 niveaux pour catégoriser les variations de séquence somatique — basé sur les recommandations consensuelles de l’Association for Molecular Pathology; adapté de Li et al, 2016

3) Application clinique des données mutationnelles obtenues 

Diagnosic : Les critères diagnostiques des NMP de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) de 2016 reposent fortement sur les paramètres de la FSC, de l’évaluation morphologique moelle osseuse et la cytogénétique, avec un rôle relativement plus faible pour les mutations génétiques¹³. Bien qu’un cadre de gènes communs soit muté dans les NMP, les altérations génétiques définissant clairement la maladie sont rares, à quelques exceptions près. Les mutations activatrices dans JAK2 sont présentes dans environ 99 % des cas de polycythémie vraie, et la majorité des patients atteints de thrombocytémie essentielle et de myélofibrose portent une mutation activatrice dans JAK2, CALR ou MPL¹⁴. Dans le domaine pédiatrique, plus de 90 % des cas de leucémie myélomonocytaire juvénile sont porteurs d’une mutation activatrice dans les gènes impliqués dans la régulation de la voie RAS (KRAS, NRAS, PTPN11, CBL ou NF1), conduisant à leur incorporation dans ses critères diagnostiques¹³. Enfin, des mutations du gène d’épissage SF3B1 sont présentes chez les patients atteints de NM avec des sidéroblastes en couronne (SC)¹⁵. La spécificité de cette association se reflète dans les critères diagnostiques de l’OMS pour le SMD-SC, où, en présence de cytopénies et de dysplasie, la détection d’une mutation SF3B1 peut permettre d’établir ce diagnostic lorsque les SC ne représentent que 5 % de toutes les cellules érythroïdes nucléées, par rapport au seuil traditionnel de 15 %¹³.

Inversement, la majorité des gènes mutés récurrents dans les tumeurs malignes myéloïdes ne sont pas spécifiques à une entité particulière de maladie; par exemple, les mutations TET2 sont répandues dans les LMA, SMP, NMP et les NMP/SMD qui se chevauchent¹⁶. Pour compliquer encore davantage les choses, des mutations somatiques récurrentes dans les gènes associés aux NM ont été identifiées dans le sang d’individus sans maladie hématologique^17-19. Ces mutations sont un puissant prédicteur indépendant pour le développement futur des NM. Le risque absolu de transformation maligne est cependant faible, de 0,5 à 1 % par an environ, ce qui conduit à cette entité appelée « hématopoïèse clonale de signification indéterminée (CHIP) »²⁰. Ainsi, la clonalité, telle que définie par la présence de mutations somatiques associées à la NP, ne devrait pas être considérée comme une preuve définitive d’une maligne hématologique franche en l’absence d’altérations de la FSC ou d’une pathologie de la moelle osseuse.

Pronostic : Compte tenu du rôle pathogène central des mutations génétiques dans les NM, il s’ensuit qu’elles ont le potentiel de nous aider à mieux comprendre le risque de la maladie. L’European Leukemia Net (ELN) a proposé un schéma de stratification du risque pour la LMA basé sur les résultats cytogénétiques et le SNG (Tableau 4A)²¹. Les mutations bialléliques dans CEBPA ou NPM1 confèrent un pronostic favorable, tandis que les mutations dans ASXL1, RUNX1, TP53 et FLT3-ITD (en particulier avec un rapport allélique élevé) confèrent un risque dévaforable, ce qui incitera les cliniciens à envisager une consolidation avec une allogreffe de cellules souches (alloGCS) chez les patients admissibles.

Tableau 4A. Stratification du risque dans la LMA selon l’European LeukemiaNet (ELN); adapté de Döhner et al, 2016.
* Ratio Allélique, calculé par FLT3-ITD/FLT3-sauvage; bas < 0.5; haut ≥ 0.5.
** Sans lésions génétiques à risque défavorable.
§ Cytogénétique complexe : 3 ou plus anomalies chromosomiques non apparentées; caryotype monosomale : 1 monosomie unique en association avec au moins 1 monosomie supplémentaire ou anomalie chromosomique.
¶ Sauf si cela se produit avec un sous-type de LMA à risque favorable.

La stratification du risque basée sur le SNG émerge également dans les hémopathies malignes myéloïdes chroniques. Les mutations dans ASXL1, EZH2, IDH1/2, SRSF2 et U2AF1 (à Q157) définissent un groupe à haut risque moléculaire (HRM) dans la myélofibrose^22,23, et sont intégrées aux facteurs de risque traditionnels dans les systèmes de stratification pronostique tels que le MIPSS702424 et MIPSS70 version plus 2.0²⁵ (Tableau 4B/C) qui s’efforcent d’identifier les patients pour lesquels une alloGCS doit être envisagée. Il en est de même pour le SMD; plusieurs groupes ont mis au point des modèles de prédiction du risque qui améliorent le système traditionnel International Prognosis Scoring System (IPSS) et l’IPSS-R, en intégrant des données mutationnelles^26-28. Bien que les caractéristiques moléculaires exactes de ces systèmes varient, des thèmes communs ont émergé.  Par exemple, un nombre absolu plus élevé de gènes mutés ainsi que des altérations du TP53 (en particulier bi-alléliques) confèrent un impact pronostique négatif²⁹, tandis que les altérations du SF3B1 sont généralement associées à une maladie à faible risque, bien que cela puisse être modulé par une co-mutation²⁸. Un atout notable de ces nouveaux outils de score pronostic est qu’au lieu de simplement classer les patients en grandes catégories, des prédictions de résultats personnalisées sont générées pour chaque patient, ce qui permet une estimation plus précise du risque de la maladie.

Tableau 4B. Myélofibrose – MIPSS70; adapté de Guglielmelli et al, 2018.
*Perte de poids >10 % du poids de base dans l’année précédant le diagnostic, fièvre inexpliquée ou sueurs excessives persistant pendant plus de 1 mois.
§Catégorie à HRM : mutation dans l’un des ASXL1, EZH2, SRSF2 ou IDH1/2

Tableau 4C. Myélofibrose – MIPSS70 version plus 2.0; adapté deTefferi et al, 2018.
*Perte de poids >10 % du poids de base dans l’année précédant le diagnostic, fièvre inexpliquée ou sueurs excessives persistant pendant plus de 1 mois.
§Catégorie à HRM : mutation dans l’un des ASXL1, EZH2, SRSF2, U2AF1/2 ou U2AF1 à l’acide aminé Q157.
¶ Classification cytogénétique selon la référence 44.
– Favorable : caryotype normal; 20q− isolée; 13q− isolée; +9 isolée; anomalie isolée du chromosome sexuel; translocation/duplication isolée du chromosome 1.
– Défavorable : +8 isolée; 7q− isolée; translocations isolées n’impliquant pas le chromosome 1; deux anomalies n’incluant pas une anomalie à très haut risque (THR); anomalies simples/multiples de 5q−; caryotype complexe sans anomalie à THR; caryotype monosomique sans anomalie à THR; anomalies isolées non classées autrement.
– Très haut risque : monosomie 7 simple/multiple ; anomalies uniques/multiples inv(3)/3q21; anomalies simples/multiples i(17q) ; anomalies simples/multiples 12p−/12p11.2 ; anomalies uniques/multiples 11q−/11q23; trisomies autosomiques simples/multiples autres que +8 ou +9 (p. ex., +21, +19).

Thérapie : Le profil génétique d’une NM peut également fournir des informations clés concernant la réponse au traitement. Par exemple, les LMA avec un IDH1/2 muté ont un seuil apoptotique intrinsèquement inférieur, ce qui les rend particulièrement sensibles à une déplétion de la protéine anti-apoptotique, BCL-2³⁰. Par conséquent, les LMA avec IDH mutés, sont très sensibles aux schémas thérapeutiques contenant l’inhibiteur BCL-2, vénétoclax^31,32. Dans le SMD, il y a beaucoup d’intérêt à utiliser les données moléculaires pour prédire la réactivité aux agents hypométhylants (AHM).  Dans certaines études, les mutations TET2 ont prédit une réponse thérapeutique favorable, en particulier chez les individus où il s’agit d’une mutation clonale précoce^33–35. Dans une étude récente utilisant une approche d’apprentissage automatique, aucune mutation génétique simple ou combinaisons de mutations génétiques n’a prédit la réponse aux AHM; au lieu de cela, huit combinaisons génomiques prédisant la résistance aux AHM ont été identifiées. Bien qu’une validation plus poussée soit nécessaire, de telles analyses mettent en évidence le pouvoir d’évaluer les mutations génétiques, non pas isolément, mais en réseaux afin de discerner leur pertinence clinique.

La découverte du portrait mutationnel des NM a également alimenté le développement de nouvelles thérapies qui ciblent des mutations génétiques spécifiques. Les inhibiteurs de FLT3 midostaurine et giltéritinib sont apparus comme des traitements efficaces pour la LMA nouvellement diagnostiquée et en rechute/réfractaire (R/R) avec une mutation du gène FLT3, respectivement^36,37. De même, l’ivosidénib et l’énasidénib ont montré des résultats prometteurs pour la LMA R/R mutante IDH1 et IDH238,39. D’autres thérapies ciblées en sont actuellement aux premiers stades de développement.  Par exemple, l’éprenetapopt, une petite molécule qui restaure la fonction p53 de type sauvage aux cellules porteuses de mutations TP53, est actuellement à l’étude dans les NM avec une mutation TP53⁴⁰. L’inhibiteur du splicéosome H3B-8800 est en cours d’évaluation dans le cadre d’essais cliniques de phase précoce, dans l’espoir d’exploiter la vulnérabilité inhérente des cellules présentant des mutations hétérozygotes des facteurs d’épissage, à une inhibition supplémentaire de la machinerie d’épissage^41,42. Ensemble, ces thérapies laissent présager un avenir passionnant où le SNG guidera les approches thérapeutiques personnalisées chez les patients atteints de NM.

Conclusion

L’avènement de la technologie de SNG a révolutionné notre compréhension de la pathogenèse des NP, tout en offrant un potentiel signifiant pour une application clinique. Alors que les preuves continuent de s’accumuler afin de souligner son utilité, les médecins doivent apprendre à intégrer cette information dans la pratique courante. En plus de se tenir au courant de la littérature en constant développement dans ce domaine, une compréhension pratique des détails techniques et bio-informatiques relatifs à la plate-forme de séquençage utilisée est également nécessaire. Alors que les cliniciens continuent de se familiariser avec le SNG, l’avenir est extrêmement prometteur. Le profilage moléculaire sera au cœur des efforts continus visant à fournir des soins personnalisés aux patients, grâce à des prédictions individualisées du risque de la maladie et à des schémas thérapeutiques adaptés.

Remerciements : L’auteur tient à remercier la Dre Marta Davidson pour ses commentaires critiques sur le manuscrit.